Kategorisering av tumören

All vävnad som tagits från patienten sänds till patologen så att ett representativt material kan väljas för mikroskopisk och molekylärpatologisk undersökning. Detta gäller även vid sjukdomsdebut med akut blödning av oklar genes då det rekommenderas att allt material (blodkoagel) skickas till patologen för histologisk undersökning. Utifrån lokal rutin skickas vävnaden färsk eller formalinfixerad.

Med tanke på det ökande behovet av analyser av biomarkörer rekommenderas att det finns lokala rutiner för att kunna frysa färsk, ofixerad, representativ tumörvävnad i biobank. Det är viktigt att den frysta vävnaden är representativ för tumörens högsta malignitetsgrad.

Färska preparat tas vanligen emot vardagar, kontorstid cirka 08.00–16.30 och övriga tider efter överenskommelse. Färskt prov som skickas till patologen bör transporteras svalt eller kallt men inte ligga direkt på is (skapar artefakter). Om preparatet inte kan omhändertas direkt på patologen (till exempel under helgtid och övrig tid för akuta operationer) bör det fixeras i 4-procentig buffrad formaldehydlösning.

För alla operationsfall ska en del av den tillvaratagna vävnaden fixeras och paraffininbäddas. Uppvisar materialet varierande karaktär ska bitar från de olika typerna inbäddas för undersökning. Är materialet begränsat ska allt material undersökas mikroskopiskt.

Vävnad sparas och den opererande enheten ska inhämta patientens samtycke till detta i enlighet med biobankslagen. Det paraffininbäddade materialet sparas enligt lokala rutiner och för frysning används ultralåga temperaturer (-70 – -86 ºC).

Intraoperativ diagnostik görs av följande skäl och på följande indikationer:

• För att verifiera att den patologiska processen är identifierad.
• Vid ett begränsat ingrepp till exempel biopsi, för att fastställa att viabel tumörvävnad finns tillgänglig för vidare diagnostik.
• Tumör eller infektion – val av metod, ev. odling eller annan direkt provtagning.
• Misstanke om tumör som kräver speciell åtgärd vid operationen (speciellt lymfom).

Kirurgen kan be om en intraoperativ bedömning (med fryssnitt och/eller utstryk) vilket i första hand görs om ett utlåtande påverkar operationsförloppet. Den akuta hanteringen är resurskrävande och mer vävnad behövs vid fryssnittning än vid normalt hanterad diagnostik. Intraoperativ diagnostik ger ofta inte lika konklusiv diagnostik som den normalt hanterade och därför bör strävan vara att inte överutnyttja denna resurs. Detta preparat bör tas från makroskopisk representativ tumörvävnad. Preparat för intraoperativ bedömning skickas efter ett telefonmeddelande direkt till neuropatologens laboratorium för omedelbar hantering med utstryk och/eller fryssnittning.

Likvorprover skickas ofixerade, så färska som möjligt, efter telefonkontakt med cytologlaboratoriet.

Olika tumörtyper kräver att olika diagnostiska metoder används och detta i sin tur kan kräva olika former av omhändertagande av vävnaden. För att rätt prioritera hur vävnaden omhändertages behöver ansvarig patolog relevant information. Detta ställer stora krav på exakta uppgifter i remissen, detta särskilt om materialet är begränsat.

Remissen bör innehålla uppgifter om:

• patientdata
• symtom och hur länge patienten haft besvär samt om patienten har andra sjukdomar
• tidigare operation av hjärntumör/ryggmärgstumör
• annan känd primärtumör
• tumörens läge/lokalisation: intra/extraaxiellt, supra-/infratentoriellt, medellinje/lateralt etc
• tumörens uppskattade storlek
• kontrastuppladdning i tumören: ja/nej
• andra radiologiska fynd av betydelse (till exempel fynd från MRT eller PET)
• kortisonbehandling, dos och behandlingsduration
• tidigare emboliserings-, strål- eller cytostatikabehandling
• operationsfynd, till exempel förekomst av nekros, blödning eller trombotiserade kärl
• medgivande enligt biobankslagen
• speciella förbehåll/önskningar från patienten.

Informationen kan med fördel listas i en svarsmall.

Det neuropatologiska utlåtandet ska innehålla uppgifter om nedanstående parametrar, vilka med fördel kan listas i en svarsmall.

• Identifiering av patienten (utifrån uppgift på remissen)
• Tumörlokal (remissuppgift)
• Lateralitet (remissuppgift)
• Provtyp (resektion, öppen biopsi eller stereotaktisk biopsi; remissuppgift)
• Makroskopisk beskrivning inkl. preparatstorlek (största dimension och övriga dimensioner; för fragmenterat material kan en aggregerad storlek anges, vid större preparat kan ev. vikt anges)
• Bevarat material (allt eller representativa bitar).

• Histopatologisk klassificering (inklusive beskrivning av preparation utstryk, fryssnitt, FFPE).
• Gradering (enligt WHO CNS 5 grad 1–4).
• Molekylär information (om denna rapporteras på separat utlåtande ska hänvisning till vart detta svar kan sökas ingå).
• Integrerad diagnos Utlåtandet avslutas med en sammanfattning där man anger en integrerad diagnos som inkluderar tumörens morfologiska typ och malignitetsgrad enligt WHO CNS 5, samt molekylärgenetiska resultat som är relevanta för den specifika tumörtypen.
• Ytterligare prognostiska och prediktiva biomarkörer kan ingå om efterfrågade av inremitterande.

Diagnostiken av CNS-tumörer förlitar sig alltmer på molekylärpatologiska analyser till stöd för klassificering, för prognostisk värdering och för att förutsäga svar på behandling (prediktiv värdering). Analyserna kan undersöka genetiska deletioner, amplifieringar, translokationer, mutationer eller uttrycket av specifika gentranskript eller proteiner. Användandet av biomarkörer är integrerat i WHO CNS 5 och i EANO:s riktlinjer on the diagnosis and treatment of diffuse gliomas of adulthood a7861a65-e5ff-4850-b5c8-6b04ad0febb22812751175029. WHO CNS 5 utgår från resultat av metyleringsarray-analys för definitioner av tumörentiteter till skillnad från tidigare upplagor som utgick från mikroskopiska fynd.

Vuxen typ av diffusa gliom indelas enligt WHO 2021 på basen av histopatologisk klassificering, gradering och molekylär information vilket sammantaget har diagnostisk och prognostisk betydelse. Användande av immunhistokemiska och molekylärgenetiska biomarkörer kan därutöver ge prediktiv information.

Tabell 6. Biomarkörer som utgör miniminivå och rutinmässigt bör analyseras.

¹1p19q-kodeletion och ATRX är delvis komplementära analyser, se vidare nedan.

Isocitratdehydrogenas (IDH) är ett enzym som finns i fem isoformer, som var och en katalyserar reaktionen av isocitrat till α-ketoglutarat, vilket är viktigt för cellens metabolism. Mutationer i IDH1 kodon 132 är vanliga (70–80 %) i gliom av WHO-grad 2–4. Mutationer i IDH2 kodon 172 har också upptäckts i samma tumörtyper, men mycket mer sällan. Förekomst av IDH-mutation i ett infiltrerande gliom är förknippat med väsentligt förbättrad prognos avseende tid till progress och överlevnad, det gäller även höggradiga gliom. Över 80 % av IDH1-mutationer i diffusa gliom är R132H, och mot det resulterande muterade proteinet finns en monoklonal antikropp (mIDH1^R132H). Vid negativt IHC-utfall kompletteras med molekylär patologisk analys för övriga mutationer hos patienter med diffust gliom.

Oligodendrogliom är definierad som en IDH1- eller IDH2-muterad tumör med kombinerad helarmsdeletion på kromosom 1p och 19q. Om IDH1/2 mutation och 1p/19q ej kan analyseras på grund av otillräckligt material men tumören har ett för oligodendrogliom klassisk histopatologi kan tumören klassificeras som oligodendrogliom NOS (ej närmare specificerat). Om en tumör uppvisar en för oligodendrogliom klassisk histopatologi men ej IDH1/2 mutation och/eller kodeletion 1p/19q ska fortsatt utredning göras.

Oligodendrogliom med 1p- och 19q-förlust uppvisar bättre svar på cytostatikabehandling och är associerade med förlängd överlevnad. Det finns olika metoder för att utföra analysen. Den valda metoden bör analysera bortfallet av större delar av respektive arm då det har bättre prediktivt värde.

Utifrån verkningsmekanismen kan man misstänka att tumörer med låga nivåer av det DNA- reparerande enzymet MGMT (O6-metylguanin-DNA metyltransferas) svarar bättre på alkylerande cytostatika. Uttrycket av MGMT bestäms till stor del av metyleringsstatusen av genens promotor. Denna epigenetiska avstängning av MGM-genen förekommer i 40–50 % av alla glioblastom. MGMT-promotormetylering är en stark prediktiv markör för valet mellan alkylerande cytostatika och strålbehandling, när det gäller äldre personer (över 65 år) som behöver behandling mot glioblastom. Metylering kan testas med olika PCR-baserade analyser av genomiskt DNA. Immunhistokemi är inte en adekvat metod för att undersöka MGMT-metyleringsstatus.

Gränsen för kliniskt relevant MGMT-promotormetylering är metodspecifik. Metylering av MGMT-promotor rapporteras som ometylerad respektive metylerad, och beroende av analysmetod kan metylerad subklassificeras som låg- respektive högmetylerad.

IDH1/2-mutation och TP53-mutation i infiltrerande gliom är starkt förknippade med inaktiverande förändringar i Alpha Thalassemi/Mental retardation syndrom X-länkad (ATRX), en gen som kodar ett protein som är involverat i kromatin remodellering. Mutation hos ATRX är därmed en markör för astrocytärt ursprung bland IDH-muterade diffusa gliom som saknar 1p/19q- helarmsdeletion. Undersökning bör göras för astrocytom grad 2–4 om ej kombinerad helarmsdeletion på kromosom 1p och 19q har exkluderats.

Immunhistokemi för ATRX demonstrerar en förlust av proteinuttryck i neoplastiska celler som hyser inaktiverande mutationer, medan uttrycket kvarstår i icke-neoplastiska celler i provet (till exempel endotelceller).

Den mest tillförlitliga och tekniskt genomförbara markören för proliferation i gliom är Ki-67, en nukleär antigen uttryckt i celler som är aktiva i cellcykeln men inte uttrycks i vilofasen, G0.

Andelen positivt inmärkta tumörcellskärnor uttrycks i procent (Ki-67-proliferationsindex). Svagheten med Ki-67-proliferationsindex är att utfallet varierar med hur vävnaden är behandlad (bland annat fixeringsgrad) och med den immunhistokemiska metoden. Det finns heller ingen standardiserad kvantifieringsmetod, proliferationen kan variera i olika delar av tumören och fastställda utfallsnivåer saknas. Om man beaktar dessa begränsningar kan dock utfallet bidra med en prognostisk indikation och vara till hjälp i histologiska gränsfall, till exempel i gränsfall mellan WHO- grad 2–3 och 3–4. Här kan ett förhöjt Ki-67-proliferationsindex tyda på en mer aggressiv tumör. Noteras kan att även icke-tumörceller som exempelvis reaktiva och inflammatoriska celler kan uppvisa Ki-67 positivitet vilket bör vägas in i bedömningen.

P53-proteinet är viktigt för den kontrollerade celldöden, apoptosen. Avsaknad av normalt p53 är en viktig del av tumorigenesen i många tumörtyper. Mutationer av TP53 finns i 60–80 % av alla diffusa astrocytom grad 2–4, men är sällsynta i oligodendrogliom. Utbredd nukleär immunhistokemisk reaktivitet för p53-proteinet kan inge misstanke om diffust hemisfäriskt gliom med H3 G34 mutation.

Immunhistokemisk analys av histon H3-K27M rekommenderas för diffust infiltrerande gliom som är lokaliserade i CNS-medellinjen (talamus, hjärnstammen och ryggmärgen) för att identifiera och diagnostisera diffust medellinjesgliom grad 4, så som den är definierad enligt WHO CNS 5. H3 K27M-mutation kan förekomma vid andra tumörtyper utan att vara förknippad med dålig prognos. Därför bör diagnosen diffust medellinjesgliom, H3 K27 muterat, grad 4, vara reserverad uteslutande för diffust infiltrerande, centralt lokaliserade gliom med H3 K27-mutation.

Immunhistokemisk och molekylärgenetisk analys av BRAF V600E rekommenderas vid misstanke om bland annat pleomorft xantoastrocytom och epiteloitt glioblastom.

I WHO CNS 5 anges generellt för alla subtyper inom gruppen vuxen typ av diffusa gliom att DNA-metyleringsprofil på bas av metyleringsarray-analys är eftersträvansvärd. Som basen för tumörklassificering i WHO CNS 5 används DNA metyleringsprofil i första hand och mikroskopisk bild eller andra kännetecken i andra hand.

Diffusa gliom med EGFR-amplifiering och/eller kombinerad kromosom 7-förvärv/kromosom 10-förlust och/eller TERT-promotormutation ingår som alternativkompletterande diagnostiska kriterier för glioblastom grad 4. Diffusa gliom grad 2–3 utan IDH1/2-mutation ska undersökas för EGFR-amplifiering, förvärv av hela kromosom 7, förlust av kromosom 10 och TERT-promotormutationer eller med metyleringsarrayanalys för att identifiera glioblastom grad 4.

Ependymala tumörer klassificeras med en kombination av histopatologiska och molekylära fynd sammanvägda med anatomisk lokalisation (supratentoriell region, posterior fossa respektive ryggradsregionen). Subependymom förekommer i alla tre regionerna.

Supratentoriellt ependymom är en supratentoriell tumör med morfologiska och immunhistokemiska kännetecken på ependymom där genetisk analys har utförts men inte påvisat någon fusionsgen involverande ZFTA (C11orf95) eller YAP1 och kallas då supratentoriellt ependymom, NEC (not elsewhere classified) eller där genetisk analys inte har eller inte har kunnat utföras och kallas då supratentoriellt ependymom, NOS (not otherwise classified). CNS WHO grad 2 eller 3.

Supratentoriellt ependymom, ZFTA fusions-positivt är en supratentoriell tumör med morfologiska och immunhistokemiska kännetecken på ependymom där genetisk analys har påvisat fusionsgen involverande ZFTA (C11orf95). Oftast är ZFTA fuserad med RELA. CNS WHO grad 2 eller 3.

Supratentoriellt ependymom, YAP1 fusions-positivt är en supratentoriell tumör med morfologiska och immunhistokemiska kännetecken på ependymom där genetisk analys har påvisat fusionsgen involverande YAP1. CNS WHO grad 2 eller 3.

Ependymom i posterior fossa är en tumör i bakre skallgropen med morfologiska och immunhistokemiska kännetecken på ependymom med avsaknad av morfologiska tecken på subependymom där genetisk analys inte kunnat fastslå en specifik molekylär variant (not elsewhere classified; NEC) eller varit obedömbar, inte genererat några resultat eller inte varit möjlig att utföra NOS (not otherwise classified). CNS WHO grad 2 eller 3.

Bakre skallgrops grupp A ependymom är en tumör i bakre skallgropen med morfologiska och immunhistokemiska kännetecken på ependymom och utbredd förlust av nukleärt H3 p.K28me3 (K27me3) i tumörceller eller DNA metyleringsprofil förenlig med grupp A ependymom. CNS WHO grad 2 eller 3.

Bakre skallgrops grupp B ependymom är en tumör i bakre skallgropen med morfologiska och immunhistokemiska kännetecken på ependymom och DNA metyleringsprofil förenlig med grupp B ependymom. CNS WHO grad 2 eller 3.

Spinalt ependymom är en spinal tumör med morfologiska och immunhistokemiska kännetecken på ependymom och avsaknad av morfologiska tecken på myxopapillärt ependymom eller subependymom. Är vanligen av CNS WHO grad 2 men kan vara av CNS WHO grad 3.

Spinalt ependymom, MYCN-amplifierat är en spinal tumör med morfologiska och immunhistokemiska kännetecken på ependymom och MYCN-amplifiering. Trots att merparten av dessa tumörer uppvisar höggradiga histopatologiska egenskaper och har dålig prognos så finns ännu ingen CNS WHO grad fastslagen.

Myxopapillärt ependymom är ett gliom med papillär struktur och perivaskulära myxoida förändringar (eller åtminstone fokala myxoida microcystor) och immunreaktivitet för GFAP. CNS WHO grad 2.

Subependymom är ett gliom med klungor av tumörcellskärnor liggande i en riklig, fokalt microcystisk, fibrillär matrix utan uttalad nukleär atypi samt frånvaro av eller minimal mitotisk aktivitet. CNS WHO grad 1.

GCT-diagnosen kräver biopsi av tumörvävnad, där diagnostiken av CNS- GCT vilar på både histomorfologiskt utseende och immunhistokemisk undersökning där markörerna i tabell 12 är rekommenderade (WHO 5th ed):

• PLAP, en markör för primordiala germinalceller, är positiv i 82,6 % av alla germinom.
• AFP är positiv i blandat teratom och gulesäckstumör.
• HCG är positiv i koriokarcinom och blandad germinalscellstumör.

Dessutom bör följande analyser utföras:

• Likvoranalys (cytologi, AFP och HCG) och serumprov (AFP, HCG) ska göras på alla patienter.
• Germinom ska alltid ha normala AFP-nivåer i serum och likvor, men kan ha en lätt HCG-stegring.

Tabell 12. Uttryck av immunhistokemiska markörer i CNS-GCT (WHO 5th ed).

¹ 5-metylcytosine, ² lågmolekylärt cytokratin

WHO CNS 5 nödvändiga kriterier för Meningeom (WHO grad 1):

Klassisk histopatologiskt utseende matchande minst en av subtyperna av meningeom.

ELLER

Histopatologiskt utseende tydande på meningeom kombinerat med biallelisk inaktivering av NF2 eller andra klassiskt drivande förändringar för konventionellt meningeom (TRAF7, AKT1, KLF4, SMO, PIK3CA), klarcellsmeningeom (SMARCE1), eller rhabdoitt meningeom (BAP1).

ELLER

Histopatologiskt utseende tydande på meningeom kombinerat med någon för meningeom definierad DNA metyleringsklass.

Ytterligare önskvärda kriterier

• lokalisation till hjärnhinnor
• EMA immunreaktivitet
• stark och diffus SSTR2A immunreaktivitet.

Klassiska kopietalsförändringar för NF2-muterat meningeom, som monosomi 22/22q i låggradiga meningeom, med ytterligare förluster på 1p, 6, 10q, 14q, och/eller 18 i höggradiga meningeom.

WHO CNS 5 nödvändiga extra kriterier för Atypiskt Meningeom (WHO grad 2)

4 till 19 mitoser i 10 konsekutiva högförstorande synfält om 0.16 mm2 vardera (minst 2.5/mm²)

ELLER

Otvetydig hjärninvasion (ej enbart perivaskulär spridning eller tryck mot hjärnan utan pialt genombrott)

ELLER

Specifik morfologisk subtyp (kordoid eller klarcellig)

ELLER

Minst tre av följande:

• ökad cellularitet
• små celler med hög kärn:cytoplasma-kvot
• framträdande nukleoler
• sheeting (jämn matta av tumörceller som växtmönster)
• foci av spontana (icke-iatrogena) nekroser.

WHO CNS 5 nödvändiga extra kriterier för Anaplastiskt (Malignt) Meningeom (WHO grad 3)

20 eller fler mitoser i 10 konsekutiva högförstorande synfält om 0.16 mm2 vardera (minst 12.5/mm²)

ELLER

Uppenbar anaplasi (sarkom-, karcinom-, eller melanom-liknande utseende)

ELLER

TERT promotor mutation

ELLER

Homozygot deletion av CDKN2A och/eller CDKN2B.