Kategorisering av tumören

Histopatologisk och molekylärbiologisk diagnostik av olika tumörtyper kräver olika former av omhändertagande. Detta ställer stora krav på remissformuleringen, så att vävnader kan hanteras på ett optimalt sätt på patologen.

Remissen bör innehålla uppgifter om:

• patientdata, något om symtom och hur länge patienten haft besvär samt om patienten har andra sjukdomar
• tidigare operation av hjärntumör/ryggmärgstumör
• annan känd primärtumör
• tumörens läge
• tumörens storlek
• kontrastladdning: ja/nej
• andra radiologiska fynd av betydelse (t.ex. fynd från MRT eller PET)
• kortisonbehandling, dos och behandlingsduration
• tidigare strål- eller cytostatikabehandling
• operationsfynd, t.ex. förekomst av nekros, blödning eller trombotiserade kärl
• medgivande enligt biobankslagen
• speciella förbehåll/önskningar från patienten.

All vävnad som tagits från patienten sänds till patologen så att ett representativt material kan väljas för mikroskopisk undersökning. Detta gäller även vid sjukdomsdebut med akut blödning av oklar genes då det rekommenderas att allt material (blodkoagel) skickas till patologen för histologisk undersökning. Utifrån lokal rutin skickas vävnaden färsk eller formalinfixerad. Med tanke på det ökande behovet av analyser av biomarkörer rekommenderas att lokala rutiner utvecklas för att kunna frysa färsk, ofixerad, representativ tumörvävnad i biobank. Det är viktigt att den frysta vävnaden är representativ för tumörens högsta malignitetsgrad. Färska preparat tas vanligen emot vardagar, kontorstid cirka 08.00–16.30, och övriga tider efter överenskommelse. Färskt prov som skickas till patologen bör transporteras svalt eller kallt, men inte ligga direkt på is (skapar artefakter). Om preparatet inte kan omhändertas direkt på patologen (t.ex. under helgtid och övrig tid för akuta operationer), bör det fixeras i 4-procentig buffrad formaldehydlösning.

För alla operationsfall ska en del av den tillvaratagna vävnaden fixeras och paraffininbäddas. Uppvisar materialet varierande karaktär ska bitar från de olika typerna inbäddas för undersökning. Är materialet begränsat ska allt material undersökas mikroskopiskt.

Det paraffininbäddade materialet sparas i befintliga arkiv och det frysta i -70 ºC. Vävnaden sparas i enlighet med biobankslagen, och den opererande enheten ska inhämta patientens samtycke till detta.

Intraoperativ diagnostik görs av följande skäl och på följande indikationer:

• För att verifiera att den patologiska processen är identifierad.
• Vid ett begränsat ingrepp, t.ex. biopsi, för att fastställa att viabel tumörvävnad finns tillgänglig för vidare diagnostik.
• Tumör eller infektion – inför ev. odling eller annan direkt provtagning.
• Misstanke om tumör som kräver speciell åtgärd vid operationen (speciellt lymfom).

Kirurgen kan be om ett intraoperativt fryssnitt, vilket i första hand görs om ett utlåtande påverkar operationsförloppet. Den akuta hanteringen är resurskrävande och ger ofta inte lika konklusiv diagnostik som normalt hanterad diagnostik, och man bör därför sträva efter att inte överutnyttja denna resurs. Detta preparat bör tas från makroskopisk representativ tumörvävnad. Preparat för fryssnitt skickas efter ett telefonmeddelande direkt till neuropatologens laboratorium för omedelbar hantering med utstryk och/eller fryssnittning.

Likvorprover skickas ofixerade, så färska som möjligt, efter telefonkontakt med cytologlaboratoriet.

Isocitratdehydrogenas (IDH) är ett enzym som finns i fem isoformer, som var och en katalyserar reaktionen av isocitrat till α-ketoglutarate, vilket är viktigt för cellens metabolism. Mutationer i IDH1 är vanliga (70–80 %) i gliom av WHO-grad II och III, liksom i de sekundära glioblastom som utvecklats från dessa (Capper et al., 2010). Mutationer i IDH2 har också upptäckts i samma tumörtyper, men mycket mer sällan. Förekomst av IDH-mutation i ett infiltrerande gliom är förknippat med väsentligt förbättrad prognos avseende tid till progress och överlevnad; det gäller även höggradiga gliom. Över 90 % av IDH1-mutationer i diffusa gliom är R132H, och mot det resulterande muterade proteinet finns en monoklonal antikropp (mIDH1R132H) (X. Y. Liu et al., 2012). Vid negativt IHC-utfall bör man komplettera med molekylär patologisk analys för övriga mutationer hos patienter med gliom grad II–III samt hos patienter under 55 år med glioblastom med förlorat ATRX-uttryck.

Oligodendrogliom är definierad som en IDH1- eller IDH2-mutant tumör med 1p19q-dubbeldeletion (D. N. Louis et al., 2016). Om immunhistokemiska och molekylärgenetiska resultat är inkonklusiva och morfologin är väcker misstanke om oligodendrogliom kan tumören klassificeras som oligodendrogliom NOS (ej närmare specificerat). Diagnosen oligoastrocytom bör vara reserverad för ovanliga gliom med två olika tumörkomponenter vars morfologiska, immunhistokemiska och molekylärgenetiska karaktäristika överensstämmer med astrocytom respektive oligodendrogliom (Louis D. N., 2016; Weller et al., 2017). IDH1/2-muterade gliom med karakteristisk oligodendrogliom morfologi utan 1p19q-dubbeldeletion bör klassificeras som diffust gliom, IDH-mutant, NEC (not elsewhere classified) enligt cIMPACT-NOW (D. N. Louis, Wesseling, et al., 2018).

Oligodendrogliom med 1p- och 19q-förlust uppvisar bättre svar på cytostatikabehandling och är associerade med förlängd överlevnad. Det finns olika metoder för att utföra analysen. Den valda metoden bör analysera bortfallet av större delar av respektive arm då det har bättre prediktivt värde (D. N. Louis et al., 2016).

Utifrån verkningsmekanismen kan man misstänka att tumörer med låga nivåer av det DNA-reparerande enzymet MGMT (O6-metylguanin-DNA metyltransferas) svarar bättre på alkylerande cytostatika. Uttrycket av MGMT bestäms till stor del av metyleringsstatusen av genens promotor. Denna epigenetiska avstängning av MGM-genen förekommer i 40–50 % av alla glioblastom. MGMT-promotormetylering är en stark prediktiv markör för valet mellan alkylerande cytostatika och strålbehandling, när det gäller äldre personer (över 65 år) som behöver behandling mot glioblastom (Bell et al., 2018; Herrlinger et al., 2019; Leu et al., 2013; Shields et al., 2014; van den Bent et al., 2017; Wick et al., 2013). Metylering kan testas med olika PCR-baserade analyser av genomiskt DNA. Immunhistokemi är inte en adekvat metod för att undersöka MGMT-metyleringsstatus.

Gränsen för kliniskt relevant MGMT-promotormetylering är metodspecifik. Metylering av MGMT-promotor rapporteras som ometylerad respektive metylerad, och beroende av analysmetod kan metylerad subklassificeras som låg- respektive högmetylerad. 

IDH1/2-mutation och TP53-mutation i infiltrerande gliom är starkt förknippade med inaktiverande förändringar i Alpha Thalassemi/Mental retardation syndrom X-länkad (ATRX), en gen som kodar ett protein som är involverat i kromatin remodeling (X. Y. Liu et al., 2012). Mutation hos ATRX är därmed en markör för astrocytärt ursprung bland IDH-muterade gliom som saknar 1p/19q-dubbeldeletion. Mutationer är mest frekventa i astrocytom av grad II och III och i sekundära glioblastom.

Immunhistokemi för ATRX demonstrerar en förlust av proteinuttryck i neoplastiska celler som hyser inaktiverande mutationer, medan uttrycket kvarstår i icke-neoplastiska celler i provet (t.ex. endotelceller) (Reuss, Sahm, et al., 2015).

Den mest tillförlitliga och tekniskt genomförbara markören för proliferation i gliom är Ki-67, en nukleär antigen uttryckt i celler som är aktiva i cellcykeln men inte uttrycks i vilofasen, G0. Andelen positivt inmärkta tumörcellskärnor uttrycks i procent (Ki-67-proliferationsindex). Svagheten med Ki-67-proliferationsindex är att utfallet varierar med hur vävnaden är behandlad (bl.a. fixeringsgrad) och med den immunhistokemiska metoden. Det finns heller ingen standardiserad kvantifieringsmetod, proliferationen kan variera i olika delar av tumören och fastställda utfallsnivåer saknas. Om man beaktar dessa begränsningar kan dock utfallet bidra med en prognostisk indikation och vara till hjälp i histologiska gränsfall, t.ex. i gränsfall mellan WHO-grad II–III och III–IV. Här kan ett förhöjt Ki-67-proliferationsindex tyda på en mer aggressiv tumör.

P53-proteinet är viktigt för den kontrollerade celldöden, apoptosen. Avsaknad av normalt p53 är en viktig del av tumorigenesen i många tumörtyper. Mutationer av TP53 finns i 60–80 % av alla infiltrativa astrocytom, anaplastiska astrocytom och sekundära glioblastom, men är sällsynta i oligodendrogliom. Det finns ett starkt samband mellan IDH-mutation, ATRX-mutation och TP53-mutation i diffusa astrocytom, och denna kombination av mutationer kan vara till hjälp för att skilja astrocytom från oligodendrogliom (X. Y. Liu et al., 2012). Immunhistokemisk reaktivitet för p53-proteinet kan användas som en indikation för astrocytär differentiering i diffusa gliom, eftersom det mutanta proteinet bryts ned långsammare och ackumuleras i kärnan av tumörceller.

Immunhistokemisk analys av histon H3-K27M rekommenderas för diffust infiltrerande gliom som är lokaliserade i CNS-medellinjen (talamus, hjärnstammen och ryggmärgen) för att identifiera och diagnostisera diffust medellinjesgliom, grad IV, så som den är definierad enligt WHO 2016 (Louis D. N., 2016; Weller et al., 2017). H3K27M-mutation kan förekomma vid andra tumörtyper utan att vara förknippad med dålig prognos (D. N. Louis, Giannini, et al., 2018). Därför bör diagnosen diffust medellinjesgliom, H3K27 mutant, grad IV, vara reserverad uteslutande för diffust infiltrerande, centralt lokaliserade gliom med H3K27-mutation (D. N. Louis, Giannini, et al., 2018).

Immunhistokemisk och molekylärgenetisk analys av BRAF V600E rekommenderas vid misstanke om bl.a. pleomorft xantoastrocytom och epiteloitt glioblastom (D. N. Louis et al., 2016).

Diffust astrocytom, IDH wild type, histologisk grad II eller III, med EGFR-amplifiering eller kombinerad kromosom 7-förvärv/kromosom 10-förlust eller TERT-promotormutation uppvisar ett aggressivt förlopp, motsvarande gliom av WHO-grad IV. I cIMPACT update 3 rekommenderas att diffusa astrocytom grad II–III utan IDH1/2-mutation efter sekvenseringsanalys undersöks ytterligare för EGFR-amplifiering, förvärv av hela kromosom 7, förlust av kromosom 10 och TERT-promotormutationer för att identifiera diffusa astrocytom, histologisk grad II–III, som med största sannolikt kommer att ha ett malignt kliniskt förlopp motsvarande grad IV (Brat et al., 2018).

GCT-diagnosen kräver biopsi av tumörvävnad, där den histomorfologiska diagnosen av CNS- GCT är understödd av både histomorfologisk diagnostik och immunhistokemisk undersökning (Kakkar et al., 2016; Liang et al., 2013) av följande markörer:

• PLAP, en markör för primordiala germinalceller, är positiv i 82,6 % av alla germinom.
• AFP är positiv i blandat teratom och gulesäckstumör.
• HCG är positiv i koriokarcinom och blandad germinalscellstumör.
• Likvoranalys (cytologi, AFP och HCG) och serumprov (AFP, HCG) ska göras på alla patienter.
• Germinom ska alltid ha normala AFP-nivåer i serum och likvor, men kan ha en lätt HCG-stegring (Kakkar et al., 2016; Liang et al., 2013).

Tabell 12. Uttryck av immunhistokemiska markörer i CNS-GCT (Gao et al., 2014).